青海發(fā)光桿菌菌種保藏方法操作步驟

1 培養(yǎng)基制備

1.1 器皿準(zhǔn)備 培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。

1.2 溶解培養(yǎng)基配料 先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，zui后加足水量，攪拌均勻。

1.3 調(diào)pH值 配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導(dǎo)致測量不準(zhǔn)確和營養(yǎng)成分被破壞。

1.4 加凝固劑 配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。

1.5 過濾分裝 在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。

1.6 包扎標(biāo)記 將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。

1.7 滅菌 根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。

1.8 斜面擺放 滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。

1.9 無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗，通常30℃培養(yǎng)1～3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。

2接種

2.1 斜面接種

2.1.1 點接

把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央劃線

從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。

2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。

2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。

2.1.5 挖塊接種法

挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。

2.2 穿刺接種

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。

2.3 液體接種

挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。

3 培養(yǎng)

將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般為30～37℃，真菌培養(yǎng)溫度一般為25～28℃。 4 保藏 培養(yǎng)好的菌種于4～6℃保存，根據(jù)要求每3～6個月移植一次。

某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次。 保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%～70%。 斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染造成損失。